ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
Г.В.Пономарев, В.И.Поспелов, М.А.Каплан
Изобретение относится к фармакологии, а именно к получению биологически активных соединений хлоринового ряда (см. обзор : E.S. Nyman, P.H.Hynninen, J. Photochem. Photobiol. B: Biology, Vol. 73, pp 1-28 (2004). Reserch advances in the of tetrapyrrolic photosensitizers for photodynamic therapy.) и может быть использовано для получения адипинатов моноамидов эфиров хлорина е6 с этилендиамином (I, Рис 1), которые могут найти применение в качестве высокоэффективных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии рака и других новообразований различного генезиса, а также флюоресцентной диагностики раковых клеток .
Рис 1.
Эти соединения могут быть использованы, с одной стороны, в тех же случаях, в каких применяются известные фотосенсибилизаторы (например, ФОТОЛОН, ФОТОДИТАЗИН, РАДАХЛОРИН – препараты разрешенные для применения в России, основу которых составляют соли хлорина е6 (рис 2), или же NPE6 (аспартилхлорин е6) (рис 3), препарат прошедший регистрацию в Японии), поскольку они все являются производными одного и того же макроцикла – хлорина е6 и поэтому имеют сходные спектральные характеристики (основная полоса поглощения при 662 нм в спирте и других органических средах и спектры флюоресценции), но и в других случаях, когда необходимо принципиально изменить биораспределение препарата в организме, поскольку предлагаемые нами ФС относятся к катионнозаряжннм хлоринам. Все же известные и официально разрешенные к применению ФС в РФ (ФОТОЛОН, ФОТОДИТАЗИН, РАДАХЛОРИН) (Рис 2) относятся к классу водорастворимых солей (калиевых, натриевых или N-метилглюкаминовых) хлорина е6, который представляет собой трикислоту и относятся, таким образом, к анионным ФС ( См. пат. RU 2144538, RU 2183956, RU 2276976, RU 2276976, U S Pat 6969765, U S Pat 5330741, PCT WO 2004/089409 A3).
Рис 2.
Моно-L-Аспартилхлорин е6 (NPE6, TALAPORFIN или LASERPHYRIN) Рис 3), являющийся амидным производным хлорина е6, представляет собой тетракислоту, а ее натриевые соли также прекрасно растворимы в воде (см.: Roberts, W. G., et al., In Vitro Characterization of Monoaspartyl Chlorin e6 and Diaspartyl Chlorin e6 for Photodynamic Therapy, J. Nat'l. Can. Inst., 80:330-336(1988).
Рис 3.
Характерной особенностью хлорина е6 является тот факт, что в зависимости от растворителя его спектральные характеритики сильно варьируют. Так известно, что в водных средах его максимум поглощения смещается в коротковолновую область от 662 нм в спирте до 655 нм в водном растворе при рН 9.0 и выше.
Известно, что в раковых очагах за счет бурного роста клеток и происходит некоторое изменение рН в сторону понижения, поэтому целью настоящего изобретения было создание ФС с одной стороны, имеющего те же фотофизические характеристики, что и у известных ФС, чтобы использовать такие же лицензированные лазеры для ФДТ, а с другой – заменить отрицательный заряд на периферии хлоринового макроцикла на положительный путем введения в периферический заместитель аминогуппу с тем, чтобы изменить биораспределение ФС в организме и еще более увеличить тропность ФС к опухолям.
Поставленная цель достигается следующим путем.
Спирулина обрабатывается метанолом или этанолом, содержащим 5-10% конц. серной кислоты при комнатной температуре в течение 12 часов, затем биомассу отфильтровывают, из фильтата выделяют метилфеофорбид а (II) (Рис 4 (или этилфеофорбид а (III) (Рис 5), который в растворе хлористого метилена, хлороформа или другого подходящего растворителя , обрабатывают 0.5 г-экв свежеперегнаннгого этилендиамина в течение 3-4 часов при комнатной температуре до окончания реакции (спектральный и хроматографический тест), растворитель удаляют в вакууме, кристаллический остаток суспендируют в дист. воде, отфильтровывают, промывают на фильтре дист. водой до отсутствия в фильтрате щелочной реакции за счет присутствия непрореагировавшего этилендиамина, сушат в вакууме при комнатной температуре и получают соответствующий метиловый эфир амида - моноэтилендиаминмоноамид хлорина е6 (IV) (Рис 6 ). Аналогичным образом получают соответствующий этиловый эфир (V) (Рис 7) исходя из этилфеофорбида а (II) и этилендиамина с количественным выходом. Хлоринамидамины легко растворимы в органических растворителях (хлористый метилен, хлороформ, дихлорэтан), несколько труднее в ацетоне или спирте. Эти соединения в двухфазной системе (орг. растворитель – вода) исключительно легко переходят в водную фазу при ее подкислении за счет образования трикатиона хлоринамидов.
. 
Все известные ФС на основе хлорина е6 для внутривеного использования представляют собой или водные растворы ( концентрация ~ 30 мг хлорина е6 в 10 мл воды, т.е. 0.35% раствор для РАДАХЛОРИНА или 0.5% раствор для ФОТОДИТАЗИНА с последующим разведением до 100 мл ), или приготовленный раствор порошка 100 мг тринатриевой соли хлорина е6 совместно с поливинилпирролидоном в 100 мл воды. Таким образом, концентрация ФС, расчитанная по содержанию хлорина е6, в инъекционном растворе не превышает 0.3-1.0 мг/мл.
Для получения ФС (I, R= Me, Et) исходя из соединений IV и V (рис 6) и (рис 7) поступают следующим образом: растворяют 30 мг хлорина IV или V в 5 мл этанола ректификата, добавляют 5 мл апирогенной воды, фильтруют через миллипоры 0.22 ммк, доводят водой общий инъекционный объем до 100 мл и используют по назначению.
Среди многочисленных производных хлорина е6 и мезохлорина е6, испытанных в качестве потенциальных ФС для ФДТ, известны два моноамида с этилендиамином (соединения VI и VII, рис 8 и рис 9), однако они не отличались какими-либо заметными положительными свойствами от традиционного хлорина е6 и поэтому не использовались в дальнейшем для разработки практически важного лекарственного препарата на их основе. Синтез соединений VI и VII осущетсвлялся исходя из феофорбида а (или мезофеофорбида а) или непосредственно из хлорина е6 (мезохлорина е6). Наличие у соединений VI и VII карбоксильных групп сводило на нет влияние аминогруппы, т.к. образование цвиттерионной структуры в значительной степени затрудняло выделение данных амидов, благодаря их растворимости как в кислой, так и в щелочной водной среде.
Преимущества при получении хлоринамидоаминов IV и V, по сравнению с известными ФС на основе солей хлорина е6 (ФОТОДИТАЗИНОМ, ФОТОЛОНОМ, РАДАХЛОРИНОМ, NPe6) заключаются в следующем:
- Раскрытие циклопентанонового экзоцикла в алкилфеофорбиде а до производных хлорина е6 с помощью этилендиамина происходит в мягких условиях и с количественным выходом, по сравнению с использованием водной щелочи для реакций традиционного превращения феофорбидов а в хлорин е6;
- В процессе получения амидохлоринов отсутствуют процессы деградации хлоринов до смеси других производных (например, пурпурина, хлорина е4 и др., см. сылка из http://www.sciencedirect.com/ поиск на chlorin e6 H.A. Isakau, T.V. Trukhacheva and P.T. Petrov Isolation and identification of impurities in chlorin e6 Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, In Press, Corrected Proof, Available online 24 May 2007, или патент RU 2183956.
- Получение амидохлоринов исходя из алкилфеофорбида а легко поддается масштабированию до нескольких десятков грамм в обычной химической лаборатории без привлечения специального и дорогостоящего оборудования по сравнению с синтезом хлорина е6, получение которого требует проведения реакции в условиях, максимально защищенных от действия кислорода воздуха, использования относительно больших объемов водных растворов на 1 г сырья, применения многократного промывания большими объемами апирогенной водой осадка хлорина е6 от сопутствующих примесей с последующим центрифугированием.
- Устойчивость фотосенсибилизаторов, приготовленных из амидохлоринов при хранении значительно выше, чем фотосенсибилизаторов на основе солей хлорина е6, т.е. ФОТОДИТАЗИНА, ФОТОЛОНА или РАДАХЛОРИНА, что весьма существенно при создании лекформ.
- Для повышения растворимости амидохлоринов в водно-спиртовых растворах при создании инъекционных форм ФС взаимодействием с адипиновой кислотой получены соответствующие соли – адипинаты, которые устойчивы в сухом виде или водно-спиртовых ратворах при хранении
Пример 1. К суспензии 100 г лиофильновысушенной спирулины в 300 мл метанола приливают при интенсивном перемешивании 30 мл конц. серной кислоты в течение 5 минут, перемешивают 12 часов, биомассу спирулины отфильтровывают на стеклянном фильтре №2, промывают биомассу на фильтре 100 мл метанола, объединенный фильтрат упаривают в вакууме до половины объема, разбавляют дист.водой до 500 мл, нейтрализуют при охлаждении до 10-15 оС водным 10%-ным раствором щелочи (КОН или NaOH), выпавший осадок отфильтровают через слой 2 см целита на стеклянном фильтре (D 9 см), промывают горячей водой до остутствия в фильтрате неорганических солей, сушат на воздухе, целит промывают петролейным эфиром или гексаном от жирорастворимых примесей, и затем продукт извлекают смесью хлористого метилена – ацетона (10: 1), упаривают досуха, хроматографируют на колонке с силикагелем, фракцию, содержащую метилфеофорбид а упаривают в вакууме досуха, добавляют раствор 1 мл свежеперегнанного этилендиамина в 20 мл хлористого метилена, перемешивают 2 часа, к раствору добавляют 50 мл воды, встряхивают, органический слой отделяют, промывают водой еще 2 раза до полного извлечения непрореагировавшего этилендиамина, органический слой отделяют, упаривают, хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлористый метилен-метанол (95:5), основную фракцию отделяют, упаривают и получают 350 мг 18-аминоэтилкарбамоил-20-метоксикарбонилметилl-8-этенил-13-этил-2,3-дигидро-3,7,12,17-tetramethyl-21H,23H-2-(2-метоксикарбонилэтил)порфина (IV).
Пример 2. Аналогично, из 100 г лиофильновысушенной спирулины и 300 мл абс. спирта, получают 230 мг 18-аминоэтилкарбамоил-20-метоксикарбонилметилl-8-этенил-13-этил-2,3-дигидро-3,7,12,17-tetramethyl-21H,23H-2-(2-этоксикарбонилэтил)порфина (V)
Пример 3. Смесь 250 мг метилфеофорбида а и 0.5 мл этилендиамина в 15 мл хлористого метилена выдерживают при перемешивании 3 часа и выделяют 270 мг хлорина IV.
Пример 4. Аналогично, из 250 мг этилфеофорбида а и 0.5 мл этилендиамина получают 220 мг хлорина V.
Пример 5. К раствору 50 мг хлорина IV в 10 мл смеси хлористый метилен – этанол (1:1) приливают расчитанное количество 13 мг (1 г-экв) адипиновой кислоты в 5 мл этанола, раствор упаривают досуха в вакууме и получают соль – адипинат IV (1, R=Me).
Пример 6. Аналогично из хлорина V получают соль – адапинат V (1, R=Et)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Для патента необходимо привести таблицу, в которой привести сравнительную эффективность этого фотосенсибилизатора и известных (ФОТОЛОНА, ФОТОДИТАЗИНА или РАДАХЛОРИНА)
В примерах будут даны также спектральные характеристики полученных соединений
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1.Способ получения адипинатов эфиров моноамидов хлорина е6 общей формулы (1, где R=Me или Et) , заключающийся в том, что спирулину обрабатывают 5-10% ным раствором серной кислоты в метаноле или абсолютном этаноле, выделяют метилфеофорбид а или этилфеофорбид а, обрабатывают этилендиамином в органическом растворителе, выделяют соответствующие метиловый или этиловый эфир моноамида хлорина е6, которые растворяют в этаноле, добавляют 0.5 г-экв адипиновой кислоты, полученный раствор упаривают досуха.
2 Способ получения фотосенсибилизатора заключающийся растворении адипинатов формулы 1 в 50% этаноле до концентрации 30 мг в 10 мл раствора, фильтрации через миллипоры 0.22 ммк и разбавлении полученного раствора водой до 100 мл.
Ссылки:
RU 2144538 RU 2183956 RU 2276976 RU 2276976 U S Pat 6969765 U S Pat 5330741
PCT WO 2004/089409 A3.
RU 2144538 (от 2000.01.20) Способ получения водорастворимых хлоринов (ГВП, …. Фотодитазин, старый способ)
RU 2183956 (от 2002.06.27) Фотосенсибилизатор и способ его получения (РАДАХЛОРИН)
U S Pat 6969765 (2005-11-29). (US Patent Issued on November 29, 2005 )Photosensitizer and method for production thereof (radachlorin)
U S Pat 5330741. US Patent Issued on July 19, 1994 Long-wavelength water soluble chlorin photosensitizers useful for photodynamic therapy and diagnosis of tumors
RU 2276976 (от 2006.02.10) Фотосенсибилизатор и метод его получения. (Фотодитазин, новый способ)
RU 2152790 (от 2000.07.20) Агент для фотодинамической диагностики и терапии онкологических заболеваний (ФОТОЛОН, хлорин е6 с ПВП 10-60%).
PCT WO 2004/089409 A3 (2004.10.21) Agent for the photodynamic diagnosis and therapy of malignant tumors. (Fotolon, PVP)
Реферат
Изобретение относится к фармакологии, а именно к получению биологически активных соединений и может быть использовано для получения солей моноамидов эфиров хлорина е6 с этилендиамином, которые могут найти применение в качестве высокоэффективных фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии рака и других новообразований различного генезиса. Способ получения фотосенсибилизаторов заключается в обработке суспензии лиофильновысушенной спирулины в метаноле или абсолютном спирте до получения алкилфеофорбида а с взаимодействием последнего с этилендиамином в органическом растворителе, выделении соответствующего эфира моноамида хлорина е6, его растворении в спирте добавлении адипиновой кислоты в мольном соотношении 2:1, при этом фотосенсибилизатор имеет структурную формулу 1 (рис 1), добавлении апирогенной воды так, чтобы содержание соли хлорина составляло 30-40 мг в 10 мл смеси спирт-вода (1:1).
Рис 1.
